有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上,用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头,一边灌注一边用针头梳离肺组织,直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网,分离单细胞。4、以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞:离心200×g10分钟,去上清液。轻弹试管,悬浮细胞,加入10ml低渗液(20mmol/LTris,0.75%氯化铵,pH7.4),37℃处理3~5分钟,溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理,直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。
5、离心200×g10分钟,去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液(比重1.077)上,离心400×g20分钟,收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。
6、用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数,将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上,巨噬细胞占全部细胞的90%以上。
抑制因子;巨噬细胞游走抑制因子图册
巨噬细胞游走抑制因子是集细胞因子、生长因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子。MIF高度保守,在多种急慢性炎症性疾病中发挥多种免疫功能。
在呼吸系统疾病中,气道炎症的慢性化以及气道的重塑是多种肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等的共同病理生理特征,该特征是由多种炎症细胞及细胞因子相互作用所致的气道病变。在病理生理过程中巨噬细胞起着极为重要的作用,巨噬细胞在细菌产物、烟雾等有害成分如甲醛、NO2及其他一些氧化产物剌激下,向肺组织迁移并释放多种细胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等,反过来这些细胞因子又可趋化中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞等向肺组织迁移,这些细胞和炎性细胞因子是引起气道炎症慢性化和气道严重损伤的重要因素。如果能有效地抑制细胞和炎症细胞因子的释放,就会降低及减轻气道的损伤。
为探讨白藜芦醇(Res)对小鼠肺泡巨噬细胞释放细胞因子IL-6、TNF-α的影响,研究人员经从小鼠支气管肺泡灌洗中获得肺泡巨噬细胞,分5组进行培养,各组在培养4、6、12、24小时提取上清液,应用ELISA法测定上清液中IL-6、TNF-α含量。
分子机制;巨噬细胞分子机制图册
巨噬细胞能够吞没、破坏受损伤组织,有助于启动康复过程,虽然它们在损伤位点发挥关键作用,但一旦任务完成,就需要尽快撤离,结束炎症反应,为再生过程开路。继续存在的巨噬细胞不利于组织恢复。
尽管研究人员对于启动巨噬细胞的分子机制研究的比较透彻,但关于其退出损伤位点的过程还了解甚少。研究人员鉴别出一清除外周神经损伤位点巨噬细胞的关键环节,对弄清脊髓损伤、中风和多发性硬化中相似的分子机制提供了重要线索。已知Nogo细胞受体家族与神经细胞生长有关,SamuelDavid等观测Nogo家族成员NgR1的作用。NgR1类受体是位于细胞膜上的蛋白开关,受到特异化学信号或配体刺激后,诱导细胞反应。
破坏大鼠、小鼠的大腿坐骨神经,观察NgR1在修复过程中的作用,结果发现巨噬细胞到达损伤位点后,细胞表面会表达NgR1。进一步研究发现,受损神经合成髓磷脂时,NgR1不仅阻止巨噬细胞与髓磷脂结合,而且直接排斥正在形成过程中的髓磷脂,若抑制髓磷脂再生,巨噬细胞会停留在损伤位点周围。最终,研究人员在髓磷脂上鉴别出特异激发排斥反应的分子。可应用于外周神经以外的神经(中枢神经),他们发现中风、多发性硬化和脊髓损伤过程中激活的巨噬细胞,表面都会表达NgR1。
损伤时间;在机体创伤修复过程中,巨噬细胞的作用
一个位于老鼠体内的巨噬细胞,正在延伸其假足以吞没两粒可能是病原体的颗粒。
一个位于老鼠体内的巨噬细胞,正在延伸其假足以吞没两粒可能是病原体的颗粒。图册
其一,一旦机体创伤活动开始,巨噬细胞就能大量分泌多种生物活性物质以及多种酶类物质,其中生物活性物质又称巨噬细胞源性生物因子,包括多肽转换生长因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、血小板衍生生长因子以及一氧化氮等;酶类物质主要包括胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶原激活剂等;些生物活性物质直接引导着机体修复的整进程。
其二,巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞,负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等,这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此,研究创伤修复过程中巨噬细胞释放的细胞因子的种类和含量在创伤后不同时间的变化规律,将可能从分子水平和细胞水平上提供一些与损伤时间相关的标志性变化或依据;而文献报道巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点,巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测,这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。
巨噬细胞源性细胞因子与损伤时间的关系
创伤修复是一个在时间和空间上受一定的细胞生物因子所调控的复杂生物学过程, 巨噬细胞其中巨噬细胞分泌的细胞因子在创伤修复中的活跃表达近年来已被中外学者所关注,一些已考虑作为损伤时间推断的有用参数。认为主要参与损伤修复的巨噬细胞源性细胞因子有以下几种。
转化生长因子(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)TGF-β是具有广泛生物学效应的多肽细胞因子,来源于血小板、巨噬细胞、T淋巴细胞、增殖的上皮细胞、成纤维细胞等,参与细胞的增殖分化、代谢和内外间质的形成,在组织创伤、修复、炎症、骨质再生、肿瘤发生等病理生理过程中起重要作用;TGF-β还是一种极强的免疫调节剂,能抑制多种免疫反应,对单核巨噬细胞等炎性细胞具有极强的趋化性。TGF-β通过调节细胞周期因子、转录因子、生长因子、粘附分子和细胞基质基因的启动、转录、降解等环节而实现其促进或抑制细胞生长的功能创缘组织表达。
巨噬细胞与损伤时间的关系
TGF-β能诱导中性粒细胞和巨噬细胞向创伤部位补充,促进成纤维细胞增殖和细胞基质的合成,并能促进表皮细胞的增殖。TGF-β是再生上皮化的重要标志,是皮肤基质和肉芽组织形成的重要且必不可少的条件,已证实它能影响愈合过程的各个阶段,提供正常愈合的信号物质,其中TGF-β与创伤关系最为密切。此外,TGF-β还促进成纤维细胞趋化,产生胶原和纤维连接蛋白,抑制胶原降解,促进纤维化发生。谢举临等认为TGF-β是创伤修复过程中促进切创愈合的一类强有力的细胞因子,它的表达异常直接影响伤口愈合的时间。
巨噬细胞吞噬物与损伤时间的关系
活体组织受损后,局部可发生出血、坏死,巨噬细胞吞噬组织间隙的血细胞和坏死组织后,吞噬物与胞浆内的溶酶体融合,随损伤时间的延长而逐渐降解,不能分解的物质则在胞浆内形成残留物。BetzP表明,含吞噬物的巨噬细胞如噬脂细胞、噬血红蛋白细胞和噬铁细胞最早在伤后2~3天出现,损伤组织中出现吞噬细胞的时间有部位差别。在人体,脑和皮肤组织出现噬铁细胞的时间于出血后15~17h,而在肺则出现在出血后30min左右。
组织内出血时,从血管中逸出的红细胞被巨噬细胞摄入并由其溶酶体降解,使来自红细胞的血红蛋白的Fe3+与蛋白质合成电镜下可见的铁蛋白微粒,若干铁蛋白微粒聚集成为光镜下可见的棕黄色,较粗大的折光颗粒称为含铁血黄素。
巨噬细胞 - 涉入病症的症状
因为它的功能—吞噬,巨噬细胞亦涉入许多免疫系统的症状。譬如它们会参与形成肉芽瘤的过程,及可由多种病症引起的炎症病变。
下文中会形容一些有关巨噬细胞功能和非有效吞噬的疾病,而大部份亦为罕见。
巨噬细胞亦被涉入动脉硬化症愈趋严重的血小板病变的具能力细胞。
当与流行性感冒展开“战争”时,巨噬细胞会被派至喉咙。但是在杀手T细胞将感冒病毒找出前,巨噬细胞是破坏多于帮忙。它们不只破坏受感冒病毒感染的喉咙细胞,亦会破坏数个位处附近且未被感染的细胞。
当人体受到人体免疫缺损病毒(HIV)感染时,如T细胞般,巨噬细胞也会受到感染,更在身体之中被变成持续复制的病毒的仓库。
再者,巨噬细胞亦被相信它会帮助癌细胞增生。它们会被吸引到缺氧(低氧)的肿瘤细胞附近并促进慢性炎症。巨噬细胞会释出致炎物质如肿瘤坏死基因(TNF)从而活化NF-κB的基因。其后,NF-κB 会进入肿瘤细胞核并启动多种可以停止细胞凋亡及促进细胞增生及发炎的蛋白质的产生。